Dikembangkan pada tahun 1983, proses PCR telah memungkinkan untuk melakukan sekuensing DNA dan mengidentifikasi urutan nukleotida pada gen individu.
Metode ini menggunakan siklus termal atau pemanasan berulang dan pendinginan reaksi untuk peleburan DNA dan replikasi. Saat PCR berlanjut, DNA “baru” digunakan sebagai template untuk replikasi dan reaksi berantai terjadi, secara eksponensial memperkuat template DNA.
Teknik PCR diterapkan di banyak bidang bioteknologi termasuk rekayasa protein , kloning, forensik (DNA fingerprinting), pengujian paternitas, diagnosis penyakit keturunan dan / atau infeksi, dan untuk analisis sampel lingkungan.
Pada forensik, khususnya, PCR sangat berguna karena memperkuat bahkan jumlah terkecil bukti DNA. PCR juga dapat digunakan untuk menganalisis DNA yang berusia ribuan tahun, dan teknik ini telah digunakan untuk mengidentifikasi segala sesuatu dari mammoth berusia 800.000 tahun ke mumi dari seluruh dunia.
Prosedur PCR adalah sebagai berikut:
- Inisialisasi: Langkah ini diperlukan hanya untuk polimerase DNA yang memerlukan PCR mulai panas. Reaksi dipanaskan hingga antara 94 dan 96 ° C dan ditahan selama 1-9 menit.
- Denaturasi: Jika prosedur tidak memerlukan inisialisasi, denaturasi adalah langkah pertama. Reaksi dipanaskan sampai 94-98 ° C selama 20-30 detik. Ikatan hidrogen template DNA terganggu dan molekul DNA beruntai tunggal dibuat.
- Annealing: Temperatur reaksi lebih rendah antara 50 dan 65 ° C dan ditahan selama 20-40 detik. Primer anil ke templat DNA beruntai tunggal. Suhu sangat penting selama langkah ini. Jika terlalu panas, primer mungkin tidak mengikat. Jika terlalu dingin, primernya mungkin tidak sempurna. Ikatan yang baik terbentuk ketika urutan primer sangat cocok dengan urutan template.
- Extension / Elongation: Suhu selama langkah ini bervariasi tergantung pada jenis polimerase. DNA polimerase mensintesis untai DNA yang benar-benar baru.
- Perpanjangan akhir: Langkah ini dilakukan pada 70-74 ° C selama 5-15 menit setelah siklus PCR akhir.
- Pegangan terakhir: Langkah ini opsional. Temperatur disimpan pada suhu 4-15 ° C dan mengeringkan reaksinya.
Prosedur dibagi menjadi tiga tahap:
- Penguatan eksponensial: Selama setiap siklus, produk (potongan spesifik DNA yang direplikasi) digandakan.
- Leveling-off stage: Ketika DNA polymerase kehilangan aktivitas dan mengkonsumsi reagen, reaksi melambat.
- Plateau: Tidak ada lagi produk yang terakumulasi.