Kloning gen adalah tindakan membuat salinan, atau klon, dari gen tunggal. Setelah gen diidentifikasi, klon dapat digunakan di banyak bidang penelitian biomedis dan industri. Rekayasa genetika adalah proses kloning gen menjadi organisme baru atau mengubah urutan DNA untuk mengubah produk protein. Rekayasa genetika tergantung pada kemampuan kita untuk melakukan prosedur penting berikut.
01 Polymerase Chain Reaction
02 Enzim Pembatasan
Penemuan enzim yang dikenal sebagai endonuklease restriksi sangat penting untuk rekayasa protein . Enzim-enzim ini memotong DNA di lokasi tertentu berdasarkan urutan nukleotida. Ratusan enzim restriksi yang berbeda, yang mampu memotong DNA di tempat yang berbeda, telah diisolasi dari berbagai strain bakteri. Potongan DNA dengan enzim restriksi menghasilkan banyak fragmen yang lebih kecil, dengan berbagai ukuran. Ini dapat dipisahkan menggunakan elektroforesis gel atau kromatografi.
03 Elektroforesis
Memurnikan DNA dari kultur sel, atau memotongnya menggunakan enzim restriksi tidak akan banyak berguna jika kita tidak dapat memvisualisasikan DNA - yaitu, menemukan cara untuk melihat apakah ekstrak Anda mengandung apa pun, atau berapa ukuran fragmen Anda telah memotongnya menjadi. Salah satu cara untuk melakukan ini adalah dengan elektroforesis gel. Gel digunakan untuk berbagai tujuan, dari melihat memotong DNA untuk mendeteksi sisipan DNA dan KO.
04 Gabung Dua Potongan DNA
Dalam penelitian genetika, seringkali diperlukan untuk menghubungkan dua atau lebih untai individual DNA, untuk menciptakan untai rekombinan, atau menutup untaian melingkar yang telah dipotong dengan enzim restriksi. Enzim yang disebut DNA ligase dapat menciptakan ikatan kovalen antara rantai nukleotida. Enzim DNA polimerase I dan polinukleotida kinase juga penting dalam proses ini, untuk mengisi celah atau memfosforilasi ujung 5 ', masing-masing.
05 Pemilihan DNA Self-Replicating Kecil
Potongan melingkar kecil DNA yang bukan bagian dari genom bakteri, tetapi mampu mereplikasi diri, dikenal sebagai plasmid. Plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk mengangkut gen antara mikroorganisme. Dalam bioteknologi, setelah gen yang diinginkan telah diperkuat dan baik gen maupun plasmid dipotong oleh enzim restriksi, mereka diligasi bersama menghasilkan apa yang dikenal sebagai DNA rekombinan. Viral (bakteriofag) DNA juga dapat digunakan sebagai vektor, seperti juga kosmid, plasmid rekombinan yang mengandung gen bakteriofag.
06 Metode Memindahkan Vektor Menjadi Sel Inang
Proses mentransfer materi genetik pada vektor seperti plasmid, ke sel inang baru, disebut transformasi. Teknik ini mensyaratkan bahwa sel-sel inang terpapar pada perubahan lingkungan yang membuat mereka "kompeten" atau sementara dapat diresapi ke vektor. Elektroporasi adalah salah satu teknik seperti itu. Semakin besar plasmid, semakin rendah efisiensi yang diambil oleh sel. Segmen DNA yang lebih besar lebih mudah dikloning menggunakan bakteriofag, retrovirus atau vektor virus lain atau cosmid dalam metode yang disebut transduksi. Vase atau vektor virus sering digunakan dalam pengobatan regeneratif tetapi dapat menyebabkan penyisipan DNA di bagian kromosom kita di mana kita tidak menginginkannya, menyebabkan komplikasi dan bahkan kanker.
07 Metode untuk Memilih Organisme Transgenik
Tidak semua sel akan mengambil DNA selama transformasi. Adalah penting bahwa ada metode untuk mendeteksi orang-orang yang melakukannya. Umumnya, plasmid membawa gen untuk resistensi antibiotik dan sel-sel transgenik dapat dipilih berdasarkan ekspresi gen-gen itu dan kemampuan mereka untuk tumbuh di media yang mengandung antibiotik itu. Metode pemilihan alternatif tergantung pada keberadaan protein reporter lain seperti sistem x-gal / lacZ , atau protein fluoresensi hijau, yang memungkinkan pemilihan berdasarkan warna dan fluoresensi.