Apa yang PCR Harus Dilakukan Dengan Sekuensing DNA dan Memperkuat Gen
The polymerase chain reaction ( PCR ) adalah teknik genetika molekuler untuk membuat banyak salinan gen dan juga merupakan bagian dari proses sekuensing gen.
Bagaimana Cara Kerja Polymerase Chain Reaction?
Salinan gen dibuat menggunakan sampel DNA, dan teknologinya cukup baik untuk membuat banyak salinan dari satu salinan gen yang ditemukan dalam sampel. PCR amplifikasi gen untuk membuat jutaan salinan, memungkinkan untuk mendeteksi dan mengidentifikasi urutan gen menggunakan teknik visual berdasarkan ukuran dan muatan (+ atau -) dari potongan DNA.
Dalam kondisi yang terkendali, segmen kecil DNA dihasilkan oleh enzim yang dikenal sebagai polimerase DNA, yang menambahkan deoxynucleotides gratis (dNTPs) ke sepotong DNA yang dikenal sebagai "template." Bahkan potongan DNA yang lebih kecil, yang disebut "primer" digunakan sebagai titik awal untuk polimerase. Primer adalah potongan kecil DNA buatan manusia (oligomer), biasanya antara 15 dan 30 nukleotida panjang. Mereka dibuat dengan mengetahui atau menebak urutan DNA singkat di ujung-ujung gen yang diperkuat. Selama PCR, DNA yang diurutkan dipanaskan dan untai ganda terpisah. Setelah pendinginan, primer mengikat ke template (disebut annealing) dan menciptakan tempat untuk polimerase untuk memulai.
Teknik PCR
Reaksi rantai polimerase (PCR) dimungkinkan oleh penemuan enzim thermophiles dan enzim thermophilic polymerase (enzim yang menjaga integritas struktural dan fungsionalitas setelah pemanasan pada suhu tinggi).
Langkah-langkah yang terlibat dalam teknik PCR adalah sebagai berikut:
- Campuran dibuat, dengan konsentrasi optimal dari templat DNA, enzim polimerase, primer, dan dNTP. Kemampuan untuk memanaskan campuran tanpa denaturasi enzim memungkinkan denaturasi sampel heliks ganda DNA pada suhu di kisaran 94 derajat Celcius.
- Setelah denaturasi, sampel didinginkan ke kisaran yang lebih moderat, sekitar 54 derajat, yang memfasilitasi anil (pengikatan) dari primer ke templat DNA beruntai tunggal.
- Pada langkah ketiga dari siklus, sampel dipanaskan kembali ke 72 derajat, suhu ideal untuk Taq DNA Polymerase, untuk pemanjangan. Selama elongasi, DNA polimerase menggunakan untai tunggal asli DNA sebagai templat untuk menambahkan dNTP komplementer ke ujung 3 'dari masing-masing primer dan menghasilkan bagian DNA beruntai ganda di wilayah gen yang diinginkan.
- Primer yang memiliki annealing ke sekuens DNA yang tidak sama persis tidak tetap anil pada 72 derajat, sehingga membatasi pemanjangan ke gen yang diinginkan.
Proses denaturasi, anil dan elongasi ini diulang berkali-kali (30-40) kali, sehingga meningkatkan secara eksponensial jumlah salinan gen yang diinginkan dalam campuran. Meskipun proses ini akan sangat membosankan jika dilakukan secara manual, sampel dapat dipersiapkan dan diinkubasi dalam Thermocycler yang dapat diprogram, yang sekarang umum di kebanyakan laboratorium molekuler, dan reaksi PCR lengkap dapat dilakukan dalam 3-4 jam.
Setiap langkah denaturasi menghentikan proses perpanjangan dari siklus sebelumnya, sehingga memotong untaian DNA baru dan menjaganya agar mendekati ukuran gen yang diinginkan.
Durasi siklus elongasi dapat dibuat lebih panjang atau lebih pendek tergantung pada ukuran gen yang diinginkan, tetapi akhirnya, melalui siklus PCR berulang, mayoritas templat akan dibatasi hanya pada ukuran gen yang diinginkan, karena mereka akan dihasilkan dari produk kedua primer.
Ada beberapa faktor berbeda untuk PCR sukses yang dapat dimanipulasi untuk meningkatkan hasil. Metode yang paling banyak digunakan untuk menguji keberadaan produk PCR adalah elektroforesis gel agarosa . Yang digunakan untuk memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukuran dan muatan. Fragmen kemudian divisualisasikan menggunakan pewarna atau radioisotop.
Evolusi
Sejak ditemukannya PCR, polimer DNA selain dari Taq asli telah ditemukan. Beberapa di antaranya memiliki kemampuan "mengoreksi" yang lebih baik atau lebih stabil pada suhu yang lebih tinggi, sehingga meningkatkan spesifisitas PCR dan mengurangi kesalahan dari penyisipan dNTP yang salah.
Beberapa variasi PCR telah dirancang untuk aplikasi tertentu dan sekarang digunakan secara teratur di laboratorium genetika molekuler. Beberapa di antaranya adalah PCR Waktu Nyata dan PCR Terbalik Transkripsi. Penemuan PCR juga mengarah pada pengembangan sekuensing DNA , sidik jari DNA dan teknik molekuler lainnya.