Penyesuaian terhadap salah satu komponen reaksi Polymerase Chain Reaction (PCR) dapat mengubah kualitas hasil, baik dengan meningkatkan atau mengurangi hasil dan kualitas produk atau dengan meningkatkan spesifisitas dan sensitivitas reaksi. Parameter yang mempengaruhi hasil akhir dapat berupa fisik (yaitu suhu, waktu siklus) atau kimia (yaitu, konsentrasi template, jenis enzim yang digunakan). Berikut ini adalah beberapa faktor kunci yang mempengaruhi keberhasilan PCR.
01 Kondisi Laboratorium yang Bersih
Karena PCR mampu mendeteksi satu molekul DNA, penting untuk mempertahankan kondisi murni di laboratorium. Selalu kenakan sarung tangan segar, gunakan gelas steril, tabung dan tip pipet dan larutan steril, dan bersihkan area kerja sebelum mulai bekerja.
Selalu sertakan reaksi kontrol, tanpa DNA template dan tanpa enzim, untuk memastikan hasilnya benar-benar disebabkan oleh amplifikasi sampel yang tepat.
Kebanyakan orang memastikan untuk memiliki solusi sendiri yang tidak dibagikan untuk membuat pemecahan masalah lebih mudah dan pipet yang sudah ditentukan seringkali disisihkan untuk PCR saja. Tabung PCR DNase dan RNase-free, ujung pipet yang tahan aerosol dan bekerja di lemari asam dengan sinar UV juga merupakan cara untuk meminimalkan masalah.
02 Komponen Kimia
- Memiliki 18 hingga 24 basa
- Tidak memiliki struktur sekunder (yaitu, loop jepit rambut)
- Memiliki distribusi seimbang dari pasangan G / C dan A / T
- Tidak saling melengkapi satu sama lain di ujung 3 kaki
- Memiliki suhu leleh (Tm) sekitar 5-10 derajat Celcius di bawah suhu anil, yang biasanya antara 55 dan 65 derajat Celcius
Nilai Tm untuk kedua primer juga harus sama untuk hasil terbaik.
03 Campuran Reaksi: Template dan Primer
Konsentrasi primer optimal adalah antara 0,1 dan 0,6 micromoles / L. Jumlah templat bervariasi tergantung pada jenis DNA (manusia, bakteri, plasmid).
Dengan jumlah template yang sangat rendah, ada strategi lain untuk meningkatkan hasil, seperti peningkatan jumlah siklus atau penggunaan "start panas". Selalu uji coba primer baru dengan reaksi kontrol positif, untuk memastikan mereka bekerja di bawah kondisi eksperimen spesifik Anda.
04 Campuran Reaksi: Aktivitas Enzim
Konsentrasi MgCl2 dalam campuran reaksi dapat mempengaruhi hasil PCR dan dapat memainkan peran penting dalam reaksi yang lebih teliti. Magnesium kation membentuk kompleks larut dengan dNTP untuk menghasilkan substrat aktual yang diakui enzim polimerase.
Jumlah yang sama dari keempat dNTP juga membantu mengurangi tingkat kesalahan polimerase. Aditif tertentu seperti betain, BSA, deterjen, DMSO, gliserol, dan pirofosfatase juga dapat mempengaruhi spesifisitas enzim atau efisiensi reaksi.
05 Jenis Termokopel
Ketika berbelanja peralatan laboratorium, ingat bahwa beberapa thermocyclers kurang tepat daripada yang lain dalam mempertahankan suhu yang tepat dan diinginkan.
Ini adalah salah satu daerah di mana pergi murah tidak akan terbayar dalam jangka panjang ketika Anda dihadapkan dengan reaksi rewel atau menggunakan primer yang membutuhkan kisaran suhu anil yang sempit.
Tabung reaksi berdinding tipis yang dirancang agar sesuai dengan merek thermocycler yang Anda gunakan, juga membantu mengoptimalkan suhu reaksi.
06 Pengaturan Siklus
Peningkatan hasil dapat dicapai dengan meningkatkan waktu perpanjangan sekitar setiap 20 siklus, untuk mengimbangi lebih sedikit enzim untuk memperkuat lebih banyak template. Biasanya, kurang dari 40 siklus cukup untuk mengamplifikasi kurang dari 10 molekul template ke konsentrasi yang cukup besar untuk melihat gel agarose etidium-bernoda.