Tingkat kemurnian protein yang dibutuhkan tergantung pada penggunaan akhir protein yang diinginkan.
Untuk beberapa aplikasi, ekstrak kasar cukup. Namun, untuk kegunaan lain, seperti dalam makanan dan obat-obatan, diperlukan tingkat kemurnian yang tinggi. Untuk mencapai ini beberapa metode pemurnian protein biasanya digunakan, dalam serangkaian langkah-langkah pemurnian.
Setiap langkah pemurnian protein biasanya menghasilkan beberapa tingkat kehilangan produk. Oleh karena itu, strategi pemurnian protein yang ideal adalah strategi di mana tingkat pemurnian tertinggi dicapai dalam langkah-langkah paling sedikit. Pemilihan langkah-langkah yang akan digunakan tergantung pada ukuran, muatan, kelarutan dan properti lain dari protein target. Teknik berikut ini paling tepat untuk memurnikan satu protein sitosol. Pemurnian kompleks protein cytosolic lebih rumit dan biasanya membutuhkan metode yang berbeda diterapkan.
Langkah Pertama untuk Pemurnian Protein
Langkah pertama dalam memurnikan protein intraseluler (di dalam sel) adalah persiapan ekstrak kasar .
Ekstrak akan mengandung campuran kompleks semua protein dari sitoplasma sel, dan beberapa makromolekul tambahan, kofaktor, dan nutrisi. Ekstrak kasar dapat digunakan untuk beberapa aplikasi dalam bioteknologi, namun, jika kemurnian merupakan masalah, langkah pemurnian selanjutnya harus diikuti.
Ekstrak protein kasar dibuat dengan menghilangkan puing-puing seluler yang dihasilkan oleh lisis sel, yang dicapai dengan menggunakan bahan kimia dan enzim , sonication atau French Press. Puing-puing dihapus dengan sentrifugasi, dan supernatan dipulihkan. Persiapan kasar protein ekstraseluler dapat diperoleh hanya dengan menghilangkan sel dengan sentrifugasi.
Untuk aplikasi bioteknologi tertentu, ada permintaan untuk enzim termostabil : Enzim yang dapat mentoleransi suhu tinggi tanpa denaturasi, dan tetap mempertahankan aktivitas spesifik yang tinggi. Organisme yang menghasilkan mereka kadang-kadang disebut extremophiles. Pendekatan yang mudah untuk memurnikan protein tahan panas adalah mengubah sifat protein lain dalam campuran dengan pemanasan, kemudian mendinginkan larutan (sehingga memungkinkan enzim termostabil untuk direformasi atau dilarutkan kembali, jika diperlukan. Protein yang didenaturasi kemudian dapat dihilangkan dengan sentrifugasi.
Langkah Pemurnian Intermediate
Di masa lalu, langkah kedua yang umum untuk memurnikan protein dari ekstrak kasar adalah dengan pengendapan dalam larutan dengan kekuatan osmotik tinggi (yaitu larutan garam). Asam nukleat dalam ekstrak kasar dapat dihilangkan dengan mempercepat agregat yang terbentuk dengan streptomisin sulfat atau protamin sulfat.
Pengendapan protein biasanya dilakukan dengan menggunakan amonium sulfat sebagai garam.
Protein yang berbeda akan mengendap di berbagai konsentrasi amonium sulfat . Secara umum, protein dengan berat molekul lebih tinggi mengendap dalam konsentrasi amonium sulfat yang lebih rendah. Curah hujan garam biasanya tidak menyebabkan protein yang sangat dimurnikan tetapi dapat membantu dalam menghilangkan beberapa protein yang tidak diinginkan dalam campuran dan memusatkan sampel. Garam dalam larutan kemudian dihapus dengan dialisis melalui tabung selulosa berpori, filtrasi, atau kromatografi inklusi gel.
Protokol biotek modern sering memanfaatkan banyak kit yang tersedia secara komersial yang menyediakan solusi siap pakai untuk prosedur standar. Pemurnian protein sering dilakukan menggunakan filter dan disiapkan kolom filtrasi gel. Yang harus Anda lakukan adalah mengikuti instruksi dan menambahkan volume yang tepat dari solusi yang tepat dan menunggu waktu yang ditentukan saat mengumpulkan eluant (apa yang keluar dari ujung kolom yang lain) dalam tabung tes yang baru.
- Metode kromatografi dapat diterapkan menggunakan kolom bench-top atau peralatan HPLC otomatis. Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan metode fase balik, pertukaran ion atau pengecualian ukuran, dan sampel yang terdeteksi oleh array dioda atau teknologi laser.
Visualisasi Protein dan Penilaian Pemurnian
- Kromatografi fase balik (RPC) memisahkan protein berdasarkan hidrofobitas relatifnya. Teknik ini sangat selektif tetapi membutuhkan penggunaan pelarut organik. Beberapa protein secara permanen didenaturasi oleh pelarut dan akan kehilangan fungsionalitas selama RPC. Oleh karena itu metode ini tidak disarankan untuk semua aplikasi, terutama jika protein target diperlukan untuk mempertahankan aktivitas.
- Kromatografi penukar ion mengacu pada pemisahan protein berdasarkan muatan . Kolom dapat disiapkan untuk pertukaran anion atau pertukaran kation. Kolom penukar anion mengandung fase diam dengan muatan positif yang menarik protein bermuatan negatif. Kolom pertukaran kation adalah sebaliknya, manik-manik bermuatan negatif yang menarik protein bermuatan positif. Elusi protein target dilakukan dengan mengubah pH dalam kolom, yang menghasilkan perubahan atau netralisasi kelompok fungsional yang bermuatan dari masing-masing protein.
- Kromatografi eksklusi ukuran ( filtrasi gel ) memisahkan protein yang lebih besar dari yang kecil karena molekul yang lebih besar berjalan lebih cepat melalui polimer yang terhubung ke silang dalam kolom kromatografi. Protein besar tidak masuk ke dalam pori-pori polimer sedangkan protein yang lebih kecil, dan memakan waktu lebih lama untuk melakukan perjalanan melalui kolom kromatografi, melalui rute yang kurang langsung. Eluate dikumpulkan dalam serangkaian tabung yang memisahkan protein berdasarkan waktu elusi. Penyaringan gel adalah alat yang berguna untuk memusatkan sampel protein karena protein target dikumpulkan dalam volume elusi yang lebih kecil daripada yang awalnya ditambahkan ke kolom. Teknik penyaringan serupa mungkin digunakan selama produksi protein berskala besar karena efektivitas biayanya.
- Kromatografi afinitas adalah teknik yang sangat berguna untuk "memoles" atau menyelesaikan proses pemurnian protein. Manik-manik di kolom kromatografi terkait silang ke ligan yang mengikat khusus pada protein target. Protein kemudian dihapus dari kolom dengan berkumur dengan larutan yang mengandung ligan bebas. Metode ini memberikan hasil paling murni dan aktivitas spesifik tertinggi dibandingkan teknik lainnya.
- SDS-PAGE adalah elektroforesis gel poliakrilamida, dilakukan dengan adanya SDS (sodium dodecyl sulfate) yang mengikat protein yang memberi mereka muatan negatif bersih yang besar. Karena muatan semua protein cukup sama, metode ini memisahkannya hampir seluruhnya berdasarkan ukuran. SDS-PAGE sering digunakan untuk menguji kemurnian protein setelah setiap langkah dalam rangkaian. Karena protein yang tidak diinginkan secara bertahap dikeluarkan dari campuran, jumlah pita yang divisualisasikan pada gel SDS-PAGE dikurangi, sampai hanya ada satu band yang mewakili protein yang diinginkan.
- Immunoblotting adalah teknik visualisasi protein yang diterapkan dalam kombinasi dengan kromatografi afinitas. Antibodi untuk protein tertentu digunakan sebagai ligan pada kolom kromatografi afinitas. Protein target dipertahankan pada kolom, kemudian dihapus dengan membilas kolom dengan larutan garam atau agen lainnya. Antibodi yang terkait dengan label radioaktif atau pewarna membantu mendeteksi protein target setelah dipisahkan dari sisa campuran.
Sumber:
Zubay G. 1988. Biokimia, Edisi Kedua. Macmillan Publishing Co., New York, NY, AS.
Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Buku Pedoman Pemurnian Protein, Edisi AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc. New Jersey, AS. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf.