Sekuensing DNA juga tergantung pada kemampuan kita untuk menggunakan elektroforesis gel untuk memisahkan untaian DNA yang berbeda dalam ukuran oleh sekecil satu pasangan basa.
Sekuensing DNA
Pada akhir tahun 1970-an, dua teknik sekuensing DNA untuk molekul DNA yang lebih panjang ditemukan. Ini adalah metode Sanger (atau dideoxy) dan metode Maxam-Gilbert (chemical cleavage). Metode Maxam-Gilbert didasarkan pada pembelahan spesifik nukleotida oleh bahan kimia dan paling baik digunakan untuk urutan oligonukleotida (polimer nukleotida pendek, biasanya lebih kecil dari 50 pasangan basa panjangnya). Metode Sanger lebih umum digunakan karena telah terbukti secara teknis lebih mudah untuk diterapkan, dan, dengan munculnya PCR dan otomatisasi teknik, dengan mudah diterapkan pada untaian panjang DNA termasuk beberapa gen keseluruhan. Teknik ini didasarkan pada penghentian rantai oleh dideoxynucleotides selama reaksi elongasi PCR.
Metode Sanger
Dalam metode Sanger, untai DNA yang akan dianalisis digunakan sebagai templat dan DNA polimerase digunakan, dalam reaksi PCR, untuk menghasilkan untaian bebas menggunakan primer.
Empat campuran reaksi PCR yang berbeda disiapkan, masing-masing mengandung persentase tertentu analog dideoxynucleoside triphosphate (ddNTP) ke salah satu dari empat nukleotida (ATP, CTP, GTP atau TTP). Sintesis untaian DNA baru berlanjut sampai salah satu analog ini dimasukkan, pada saat untai dipotong secara prematur.
Setiap reaksi PCR akan berakhir dengan campuran panjang untaian DNA yang berbeda-beda, semuanya berakhir dengan nukleotida yang dideteksi berlabel untuk reaksi tersebut. Gel elektroforesis kemudian digunakan untuk memisahkan untaian dari empat reaksi, dalam empat jalur terpisah, dan menentukan urutan template asli berdasarkan berapa panjang untaian yang berakhir dengan nukleotida apa.
Dalam reaksi Sanger otomatis, primer digunakan yang diberi label dengan empat tag fluorescent berwarna berbeda. Reaksi PCR, di hadapan nukleotida dideoksi yang berbeda, dilakukan seperti yang dijelaskan di atas. Namun, selanjutnya, keempat campuran reaksi tersebut kemudian digabungkan dan diterapkan pada satu jalur gel. Warna setiap fragmen dideteksi menggunakan sinar laser dan informasi dikumpulkan oleh komputer yang menghasilkan kromatogram yang menunjukkan puncak untuk setiap warna, dari mana urutan DNA template dapat ditentukan.
Biasanya, metode sekuensing otomatis hanya akurat untuk urutan hingga maksimum sekitar 700-800 pasangan basa panjangnya. Namun, adalah mungkin untuk mendapatkan rangkaian penuh gen yang lebih besar dan, pada kenyataannya, seluruh genom, menggunakan metode step-wise seperti Primer Walking dan Shotgun sequencing.
Dalam Primer Walking , bagian yang dapat dikerjakan dari gen yang lebih besar diurutkan menggunakan metode Sanger. Primer baru dihasilkan dari segmen urutan yang dapat diandalkan dan digunakan untuk melanjutkan pengurutan bagian gen yang berada di luar jangkauan reaksi asli.
Shotgun sequencing memerlukan secara acak memotong segmen DNA yang menarik menjadi fragmen-fragmen berukuran yang lebih tepat (dapat dikelola), mengurutkan setiap fragmen, dan menyusun potongan-potongan berdasarkan urutan yang tumpang tindih. Teknik ini telah dibuat lebih mudah dengan aplikasi perangkat lunak komputer untuk mengatur potongan yang tumpang tindih.